从不同样本来源分离RNA的注意事项
一些样本来源在其RNA或内含物方面存在着显著不同，可能导致RNA的分离和分析过程出现问题。当操作这些样本来源时需要一些特别注意事项。本文将针对不同样本来源的操作进行探讨。
血液血液直接源于临床分析的收集样本。在收集管中使用RNA稳定处理试剂可成功保存血液样本的RNA。从血液中分离RNA的方法，需要能够确保生成无污染物或酶抑制剂的高质量RNA。血液中所含有的大量酶抑制剂会对下游的RNA分析造成干扰。此外，如肝素和EDTA等一类常规的抗凝血剂也会干扰下游分析。同时应注意抗凝血剂并不会对RNA起到稳定化作用。
人类血液中的红血球（血红细胞）不含细胞核，因此不会合成RNA；通常情况下这类细胞仅含有非常微量的RNA，而不是RNA分离的主要对象。从全血中分离RNA的主要靶标细胞为白血球（白细胞），这类细胞含有细胞核和RNA。白血球由三种主要的细胞类型构成：淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。由于健康的血液中所含的红细胞数量约为白细胞的1000倍，去除红细胞会有助于简化RNA分离步骤。可通过选择性地裂解红细胞来达到此目的，因为红细胞对低渗休克更为敏感（相比白血球），在低渗缓冲液中会迅速发生破裂。去除红细胞的另一种常见替代方法是Ficoll密度梯度离心法。与红血球裂解法不同，Ficoll密度梯度离心法仅获取单核的细胞（淋巴细胞和单核细胞），而会去除粒细胞。经Ficoll密度梯度离心法分离出的单核细胞能够使用与其他动物细胞一样的方法进行RNA分离。
FFPE组织样品福尔马林固定，石蜡包埋(FFPE)的组织样本是生物医学研究中的重要和广泛的样本来源。越来越多的研究者开始针对FFPE样本开始分子水平的分析，因此考虑这些样本的独特属性以发展针对性的分离方法变得越来越重要。
由于在固定和包埋过程中使用了甲醛，通常会使FFPE样本中的核酸发生严重的片段化和化学改变。因此，从FFPE样本中分离到的核酸会比新鲜样本或冰冻样本的分子量更低。其片段化程度基于样本类型、保存期长短，以及固定、包埋和储存的条件而发生变化。尽管在凝胶电泳或芯片实验室（lab–on–a–chip）分析等标准质量控制分析中无法测得甲醛修饰情况，但后者实际会对酶学分析造成严重干扰。为了将FFPE储存法对RNA转录物的影响降至最低，应牢记下列小贴士：
- 尽可能快地取样和固定组织
- 不要使用厚度超过5 mm的样本，样本固定时间不宜过长（最长24小时）
- 尽可能避免对样本进行染色
- 适当地储存FFPE样本（RNA在4°C可完好保存至1年，优于保存在室温或更高温度）
- 使用适当的脱石蜡步骤
- RNA分离应包含一个解交联的步骤
从例如骨骼肌、心脏和皮肤组织一类的样本中分离RNA可能比较困难，因为此类样品中含有大量的收缩性蛋白、结缔组织和胶原。为了去除这些可能对RNA分离造成干扰的蛋白，需要使用蛋白酶或含苯酚的裂解试剂对此类样本进行处理。不过，蛋白酶的消化过程需要避免RNA发生降解。
细菌细菌mRNA的很多基本特征都不同于真核生物的mRNA。原核生物的mRNA没有5'帽子，也很少具有poly A尾。缺少poly A尾的mRNA无法通过杂交进行捕获。另外，也无法在合成初始链的过程中使用寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷（oligo–dT）引物，只能使用随机引物作为替代。
此外，细菌RNA也十分地不稳定，快速生长的品种中RNA的平均半衰期约为3分钟。某些细菌的mRNA在翻译同时即发生降解。因此对于尝试从细菌中分离mRNA的研究人员来说，这是一个大麻烦。也由于细菌中的mRNA的周转（从生成到降解）非常快，造成原核生物的基因表达研究比真核生物更为困难。为了精确地保留基因表达谱，并使完好mRNA的得率最大化，在样本获取和加工之前需要对其进行稳定处理。
RNA病毒一些病毒含有单链或双链的RNA基因组。RNA病毒通常从无细胞的体液中得到分离，在这类样本中它们的滴度非常之低。在进行RNA的分离之前，病毒颗粒可能需要超速离心、超滤或沉淀步骤进行浓缩。在RNA的分离过程中如果预期得率很低，则可能需要加入载体RNA。
病毒RNA的主要问题在于其通常具有复杂的二级结构。这使下游分析变得异常困难。许多逆转录酶的转录过程难于通过复杂的RNA二级结构。另外，RNA病毒还具有较高突变率，因为它们的复制过程并不精确，这样就很难获得均一的成分用于后续分析。
血浆或血清（或其他体液样本）中的游离RNA在血浆、血清、尿液、其他体液以及细胞培养上清中都存在着与蛋白脂质（囊泡）或蛋白质相结合的RNA，特别是miRNA。这些RNA的浓度大大低于细胞内的RNA，但比人类血浆中的游离DNA浓度要高大约10倍。在人体血液中RNA相对稳定，半衰期为2天左右。尽管如此，RNA在反复冻融的条件下依然会降解。当分离体液中的游离病毒RNA时，可能有必要加入载体RNA。
植物从植物材料中分离RNA会遇到一些特殊困难，常规技术在用于植物样本之前一般要先经过条件优化。一些植物代谢产物的化学性质与核酸相似，导致其难于从RNA制备产物中除去。（使用不当的）纯化方法（如盐类或苯酚）所导致的代谢物（例如多糖类、多酚类和黄酮类）或污染物与目的RNA的共分离，可能造成对酶促反应的抑制，或导致紫外分光光度测定和凝胶电泳结果上的偏差。从植物材料中分离RNA的过程中可能遇到的困难还包括由于较高粘性导致的吸取体积错误，以及储存过程中的RNA降解问题。通常对植物的生长条件进行优化，使其不产生高水平的植物代谢产物，可有助于对RNA的有效分离。由于植物种类之间存在较大差异，因此对其生长条件很难有同一的指导标准。不过作为普适原则，建议尽可能使用健康幼嫩的植物组织。年轻植物组织的RNA得率通常高于年老组织，因为前者在等重条件下通常比后者包含更多的细胞。而且等重的年轻组织通常也包含更少的代谢物。此外，许多“自定义”的RNA分离方法都推荐将植物组织在黑暗中培养1–2天后再进行收获，以避免形成植物代谢物的高水平积累。
