RNA实验操作常见注意事项

核糖核酸酶（RNase）是非常稳定、活跃的酶，它们通常不需要辅因子就能发挥功能。由于核糖核酸酶难以失活，并且很小的量就足以破坏RNA分子，因此在没有事先消除任何可能的核糖核酸酶污染的情况下，不要使用任何塑料或者玻璃器皿。处理RNA时应非常小心，以避免在纯化的过程中或者纯化之后，将核糖核酸酶无意的引入到RNA样品中。为了创造并维持没有核糖核酸酶的环境，在预处理以及使用一次性和非一次性的器皿和溶液处理RNA时，一定要采取以下预防措施。

常规操作

处理RNA时，一定要使用合适的微生物学的无菌技术。手和灰尘颗粒可能会携带细菌和霉菌，是最常见的核糖核酸酶污染源。为了阻止来源于皮肤表面或者实验室器械灰尘上的核糖核酸酶污染，在操纵试剂以及RNA样品的时候，一直要佩戴乳胶手套或者乙烯基手套（PVC手套）。可能的情况下，要经常更换手套，并将试管处于关闭状态。

当用移液管吸取溶液用于下游应用时，要将纯化过的RNA放在冰上。

为了去除工作台表面、非一次性塑料器皿和实验室器械（比如，移液管和电泳槽）上的核糖核酸酶污染，推荐使用市售核糖核酸酶去除溶液。也可以使用常见的实验室试剂去除核糖核酸酶的污染。为了去除塑料器皿上的污染，使用0.1 M NaOH，1 mMEDTA洗涤，然后使用去RNase的水洗涤；如果塑料器皿具有耐氯仿性，则可用氯仿洗涤。为了去除电泳槽的污染，可使用去污剂清洁（比如，0.5%的SDS），使用去RNase的水洗涤，然后用乙醇洗涤（如果电泳槽具有耐乙醇性），之后晾干。

一次性塑料耗材

在处理RNA的时候，推荐使用无菌的，一次性的聚丙烯管。这些试管通常没有核糖核酸酶，因此不需要预处理使核糖核酸酶失活。

非一次性的塑料耗材

非一次性的塑料耗材在使用之前应该进行处理，以确保其不含有核糖核酸酶。塑料耗材应该严格的使用0.1 M NaOH、1 mMEDTA洗涤，然后用去RNase的水洗涤。具有耐氯仿性的塑料耗材可以使用氯仿洗涤，以使核糖核酸酶失活。

玻璃器皿

玻璃器皿在使用之前，应该进行处理，以确保其不含有核糖核酸酶。用于处理RNA的玻璃器皿在使用之前，应该使用去污剂清洁，严格的洗涤，并在240°C的烘箱中烘烤至少4小时（如果更方便的话，可以过夜）。也可以使用DEPC（焦碳酸二乙酯）处理玻璃器皿。使用0.1%的DEPC（0.1%的水溶液）充满玻璃器皿，在37°C的条件下过夜（12小时），然后使用高压灭菌器处理或者加热到100°C 15分钟，以去除剩余的DEPC。

电泳槽

电泳槽应使用去污剂（比如，0.5%的SDS）清洁，严格的用去RNase的水洗涤，然后使用乙醇洗涤，之后晾干。

重要：一些电泳槽使用的塑料不具有耐乙醇性，需要仔细查阅厂商说明书。

不含RNase的溶液的制备

溶液（水或者其它溶液）应该使用0.1%的DEPC处理。DEPC是一种强大但非绝对的RNase抑制剂。浓度为0.1%的DEPC经常用于处理玻璃或者塑料耗材，以使其表面的RNase失活，或者制备不含RNase的的溶液和水。DEPC通过共价修饰使RNase失活。在100 ml要处理的溶液中加入0.1 ml DEPC，大力的摇晃，以使DEPC充分进入溶液。将溶液在37°C的条件下孵育12个小时。在高压灭菌器内处理15 min以去除任何DEPC的痕迹。

DEPC与伯胺发生反应，因此不能直接用于处理Tris缓冲液。在Tris缓冲液存在的条件下，DEPC非常不稳定，迅速分解为乙醇和CO2。在制备Tris缓冲液时，应先使用DEPC处理水，然后将Tris溶解以制备合适的缓冲液。

痕量的DEPC会通过乙酰基化作用，与RNA分子中的嘌呤残基反应，将其修饰。在细胞外的环境中，乙酰基化的RNA分子以很低的效率被翻译。但是，除非有大量的嘌呤残基被修饰了，否则不会严重的影响这些RNA分子杂交形成DNA：RNA或者RNA：RNA杂交物的能力。溶液或者器皿上残留的DEPC，一定要在高压灭菌器中处理或者加热到100°C处理15 min，以便除去。